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选择层析方法
用分离范围宽广的凝胶过滤介质如superose, sephacryl hr依据分子量将样品分成不同组份
用含专一配体或的亲和层析介质结合目标蛋白,一步即可得到高纯度样品;亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质
体积大的样品,往往使用离子交换层析来浓缩和粗纯化;高盐洗脱的样品再用疏水层析纯化
疏水层析用高盐吸附,低盐洗脱的原理,洗脱的样品又可直接上离子交换介质;两种方法常被交替使用
抗l体的层析分离步骤基本
都可以采用标准化的三步曲:步用protein a介质进行抗ffffff;>l
体捕获和浓缩;第二步用离子交换进行中间纯化以去除多聚体,宿主蛋白等杂质;第三步是精纯去除剩余dna,endotoxin,protein a 等微量杂质。在这三步抗ffffff;>l
体的分离纯化过程中,步的protein a亲和捕获占据分离纯化成本80%以上,也是下游分离纯化的瓶颈所在。亲和层析之所以成本高的主要原因:首先是protein a 价格昂贵,其价格是普通层析介质十几倍;第二,protein a使用寿命短,一般离子交换填料使用寿命多达1000次,而亲和填料寿命通常在100-200次;第三,protein a 用于抗ffffff;>l
体的捕获和浓缩,需要处理大体积的发酵液,而亲和步骤载量往往又低于阴阳离子交换层析,使得亲和层析介质使用量比中间纯化或精纯的要多得多。因此,要降低抗ffffff;>l
体的生产成本,东曹toyopearl纯化填料,解决抗ffffff;>l
体的生产瓶颈关键在于改进步protein a 亲和捕获。
亲和层析
配体偶联在介质上,东曹toyopearl纯化填料,纯化能与配体结合的生物分子;通常一步便能得到高纯的样品;配体的特---越强,所获产品纯度越高用亲和介质提纯单抗非常方便,以重组蛋白a的载量高;蛋白g则能结合更多不同源的igg
金属鳌合介质(chelating sepharose fast flow)可反复鳌合不同金属,再用已结合依赖不同金属的蛋白,一种介质可做多种纯化工作
其他常用配体包括:----纯化.酶iii,凝血因子脂酶等cibacron blue(颜料)-纯化白蛋白,---等外源凝集素如球蛋白a-多糖,糖蛋白等glutathione谷胱甘三肽-重组融合蛋白等等.
可自行把所需配体偶联到活化偶联介质,的是nhs activated 4 fast flow和cnbr activated 4 ff;要注意化学基好不会参与配体和被纯化生物分子的结合作用中
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